方案优势

快速，效率高，自动化，避免交叉感染，提高样品分析精度。

采用标准

国家相关标准

方法/原理/步骤

　　仪器与试剂

　　南京科捷：LC-10Tvp高压恒流泵，SPD-10Tvp紫外检测器

　　超声波清洗仪       反相色谱柱C18

　　固相萃取柱      泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考标准品均为天津市科密欧化学试剂开发中心监制

　　乙腈、正己烷均为优级纯

　　其它试剂均为分析纯

　　实验用水均为二次蒸馏水

　　新鲜牛肉与鸡肉均为超市所购

　　样品处理

　　将新鲜牛肉及鸡肉分别匀浆后，于-18℃冰箱中保存。测定时，将匀浆冷冻保存的牛肉与鸡肉样品于室温下自然解冻。分别准确称取20.0g样品置于50mL具塞锥形瓶中，加入20mL乙腈，超声10min，转移至离心管，以5000r/min离心10min，收集上清液，离心沉淀物用上述方法重复提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振荡5min，静置分层，弃去上层正己烷层。然后将溶液于40℃减压旋转蒸发至约2mL，氮气吹干后加入5mL甲醇一磷酸盐混合液超声溶解抗生素，最好定容至10mL。样品净化

　　将HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去离子水活化后，将4得到的样品处理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s)，用10mL蒸馏水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脱，将洗脱液用氮气吹干后，加入流动相超声定容至5mL，最后，经0.22um滤膜过滤后进样。

        方法的准确度、精密度、线性范围、回收率

　　对于牛肉样品分别添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3个水平的混合标准溶液，按照4与5样品处理及净化方法，每个水平平行测定4次，进行回收率实验，并且以3倍信噪比分别计算泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉样品中的检出限，在测定条件下4种药物在0.1—20mg/L范围内均呈线性，线性方程与相关系数、平均回收率、相对标准偏差。

　　实际样品检测

　　本实验分别对10份牛肉样品和10份鸡肉样品中泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考进行检测，没有发现牛肉样品中含有以上抗生素，但是在4份鸡肉样品中都不同程度检测到了泰乐菌素，最高为200ug/kg，最低为80ug/kg，平均含量为120ug/kg，高于我国动物性食品中兽药最高残留限量标准(100ug/kg)。

仪器设备

　　二、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪配置

　　LC-10Tvp高压恒流泵：2台

　　SPD-10Tvp紫外检测器：1台

　　SCL-10Tvp系统控制器：1台

　　7725i手动进样阀：1套

　　色谱工作站：1套 (VI2010、N2000、N3000选用)

　　液相色谱柱：1支 (C18 4.6*250mn,5um)

　　微量进样器：1支 (50ul/100ul)

　　进样支架 ：1只 (进样阀用)

　　                                                  LC-10Tvp高压恒流输液泵

　　输液方式                                        微体积串联双柱塞

　　最大输液压力                                      0～9999Psi

　　流量设定范围                    0.001～9.999ml/min (以0.001ml/min步长调节流量)

　　流量设定值误差                                            ≤0.5%

　　流量稳定性误差                                     ≤0.2%RSD

　　压力脉动                        小于15Psi (流量1mL/min，压力600～1600Psi。)

　　泵密封性                       压力为5400Psi，时间为10min，压降小于400Psi。

　　时间程序功能                                                    有

　　尺寸                                                W260×H130×D420mm

　　重量                                                                 11kg

　　使用环境温度范围                                         4～40℃

　　                                          SPD-10Tvp紫外可见可变波长检测器

　　波长范围                                                   190nm～700nm

　　波长示值误差                                                   ≤±1nm

　　波长重复性误差                                               ≤±0.1nm

　　动态噪声                                 ≤±0.75×10-5AU (甲醇，1ml/min，254nm，20℃。)

　　静态噪音                                      ≤±0.5×10-5AU (空池，响应时间1秒，20℃。)

　　动态基线漂移                             ≤±1×10-4AU/h (甲醇，1ml/min，254nm，20℃。)

　　静态基线漂移                               ≤0.5×10-4 (空池，响应时间1秒，20℃。)

　　线性范围                                                                ≥104

　　最小检测浓度                                     ≤1×10-9g/mL (萘/甲醇溶液)

　　定性重复性                                                   RSD6≤0.1%

　　定量重复性                                                    RSD6≤0.5%

　　光谱带宽                                                                 6nm

　　流通池体积                                                               8μL

　　光程                                                                       10mm

　　时间程序功能                                                              有

　　尺寸                                                           W260×H130×D420mm

　　重量                                                                         11kg

　　使用环境温度范围                                                 4～40℃

　　色谱条件

        C18反相色谱柱

　　柱温25℃，流速1mL/min，进样量25uL，梯度洗脱条件A相为甲醇，B相为0.2mol/L磷酸二氢钠含10%(体积比)甲醇，调节pH为3.0，梯度洗脱程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，检测波长入为275nm

　　标准溶液的配制及标准曲线的制备

　　分别准确称取各标准品0.01g(精确至0.001g)，用甲醇分别溶解并定容至100mL，配制成100mg/L标准储备液，于一4℃冰箱中冷藏，测定时将各标准溶液混合后稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分别以泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数(r)。

结论

　　我国动物性食品中兽药最高残留限量标准规定泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的最高残留量(MRL)分别为100、75、1.5、200ug/kg，本实验所测泰乐菌素、替米考星、氟苯尼考的检出限分别为20、32、16ug/kg均在最高残留限量以下，符合残留检测分析要求。由于氯霉素药物特殊性，欧盟对氯霉素的检出限要求为0.1ug/kg，美国FDA对氯霉素的检出限要求为0.3ug/kg，按照本实验方法，氯霉素检出限为19ug/kg，还未达到国际上的要求，这是因为提取方法和所用检测器所致。今后应该发展更加灵敏的方法以提高氯霉素。本实验方法的平均回收率较高(75%-87%)，而且步骤简单、操作容易、重现性较好相对标准偏差为1.35%-5.41%，表明方法稳定可靠。