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黄石市蓝图生物科技有限公司

人α-干扰素(IFN-α)定量检测试剂盒(ELISA) 说明书

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    • 【产品名称】 通用名称:人α-干扰素(IFN-α)定量检测试剂盒(ELISA) 英文名称:Human Interferon α (IFN-α) ELISA KIT 【包装规格】 48人份/盒,96人份/盒 【预期用途】 仅供科研使用,定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人α-干扰素(IFN-α)的浓度。 【检验原理】 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。在预包被抗人α-干扰素(IFN-α)抗体(固相抗体,货号:LT4030101C)的微孔酶标板中,加入人α-干扰素(IFN-α)标准品(货号:LT4030101J)、待测样本和生物素化的检测抗体(货号:LT4030101K)。经过孵育,样本中存在的 人α-干扰素(IFN-α)与固相抗体和检测抗体结合。经过洗涤去除未结合的组分,加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP),在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。洗涤后,加入显色底物 TMB,避光显色。底物在HRP催化下,产生蓝色产物,在终止液作用下,最终转化为黄色。在酶标仪上测定吸光度(OD值),吸光度(OD值)与待测样品中人α-干扰素(IFN-α)的浓度正相关。拟合标准品曲线,可以计算出样本中人α-干扰素(IFN-α)的浓度。 【主要组成成分】 主要成分 组分 48T规格 96T规格 标准品 1 vial 2 vial 预包被酶标板 96T 48T 检测抗体 1 vial 1 vial 标准品稀释液 5 ml 5 ml HRP标记的链霉亲和素 1vial 1vial 10×检测缓冲液 5 ml 5 ml 显色底物 TMB 10 ml 10 ml 终止液 10 ml 10 ml 20×浓缩洗涤液 30mL 30mL 说明书 1份 1份 自封袋 1个 1个 封板膜 3片 3片 需要但未提供的材料及耗材 1、能够检测 450 nm 吸光度的酶标仪,参考波长 570 nm 或 630 nm。 2、精密移液器及一次性吸头 3、蒸馏水或去离子水 4、洗瓶或者自动洗板机 5、37℃水浴锅或恒温箱 6、1L量筒 7、无粉一次性乳胶手套 8、稀释用聚丙烯试管 【储存条件及有效期】 1、2-8℃保存,切勿冷冻,有效期6个月。 2、开封使用后,包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中,密闭自封袋,并将全部试剂放回2-8℃冰箱。 3、开封后,按照建议的条件保存,校准品、包被微孔板和HRP标记抗体,有效期为28天,其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。 【适用仪器】 半自动的酶标仪,如Thermo MK3,或者国产酶标仪。 【样本要求】 样本类型和采集 以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中,不得使用叠氮钠做为防腐剂。 1、细胞培养上清:4000rpm条件下离心20min,去除细胞颗粒和聚合物,上清液保存在- 20℃以下,避免反复冻融。 2、血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,4000rpm条件下离心20min,小心地分离出血清,保存在- 20℃以下,避免反复冻融。 3、血浆:肝素,EDTA,或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下,离心20分钟取上清,血浆保存在-20℃以下,避免反复冻融。 样本保存和稳定性 样本在2-8℃条件下,可以储存72h,或者在- 20℃储存6个月。样本收集后,不是一次检测完,请按一次用量分装冻存,避免反复冻融,使用时在室温下解冻,确保样品均匀充分解冻。 【试剂准备】 检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。 如果浓缩的试剂出现结晶,37℃温浴,直至结晶全部溶解。 1×洗液 吸取 20×浓缩洗液 50 ml 至 1 L 的量筒,加蒸馏水或去离子水至 1000 ml,轻轻混匀,避免泡沫。 转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存,1×洗液可稳定 30 天。 1×检测缓冲液 吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒,加蒸馏水或去离子水至 50 ml,轻轻混匀,避免泡沫。 2 - 8℃贮存,1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。 检测抗体 稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量,用 1×检测缓冲液按 1:100 稀释浓缩的检测抗体。 注意:请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 稀释前充分混匀。 根据标准品和待测样本的数量,用 1×检测缓冲液按 1:100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。 注意:请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。 样本稀释 如果样本需要稀释,请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本,用细胞培养基稀释细胞培养上清 人α-干扰素(IFN-α)标准品 用蒸馏水或去离子水重溶人α-干扰素(IFN-α)标准品,重溶体积标注在人α-干扰素(IFN-α) 标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡,确保充分混匀,重溶后标准品的浓度为 1000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释前充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。 血清/血浆样本标准曲线的制作: 取 200μl 浓缩的人α-干扰素(IFN-α)标准品,加入 200 μl 标准品稀释液,作为标准曲线的最高浓度 (500 pg/ml)。在每一个试管中加入200 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1:1 系列稀释。每次移液时,请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。 细胞培养上清样本标准曲线的制作: 取200μl浓缩的人α-干扰素(IFN-α)标准品,加入 200 μl 细胞培养基,作为标准曲线的最高浓度 (500 pg/ml)。在每一个试管中加入 200 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1:1 系列稀释。每次移液时,确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。 1000 pg/ml 【操作程序】 1、所有试剂和组分都先恢复到室温,标准品、质控品和样品按前面试剂准备中描述的方法配置好,并建议做复孔。 2、从铝箔袋中取出所需板条,剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。 3.加入 350 μl 1×洗液静置浸泡25 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后, 在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后,请立即使用微孔板,不要让微孔板干燥。 4.每孔加入 50 μl 1×检测缓冲液。 5.复孔加入 50 μl 2 倍倍比稀释的标准品,空白孔复孔加入 50 μl 标准品稀释液。样本孔加入 50 μl样本。 6.每孔加入 50 μl 稀释的检测抗体。保证步骤 4、5、6 连续加样,不要间断。加样过程在 10 分钟内完成。 7.使用封板膜封板。300 转/分钟振荡,室温孵育 2 小时。 8.弃掉液体,每孔加入 350 μl 洗液洗板,洗涤 5 次。每次洗板,在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能,必须彻底移除残留液体。 9.每孔加入 100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。 10.使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡,室温孵育 45 分钟。 11.重复步骤 8。 12.每孔加入 100 μl 显色底物 TMB,避光,室温孵育 5 - 30 分钟。 13.每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。 14.在 15分钟之内,使用酶标仪进行双波长检测,测定 450 nm 最大吸收波长和 570 nm 或 630 nm 参考波长下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。仅使用 450 nm 测定会导致 OD 值偏高,并且准确度降低 【检验结果的解释】 计算标准品和样本的平均 OD 值,然后减去零浓度标准品的 OD 值。 检测完成后,以标准品浓度做为纵坐标,对应的吸光度(OD值)作为横坐标,利用计算机软件,回归分析确定最佳拟合曲线,创建标准曲线方程,通过样本的吸光度(OD值),利用方程计算样品的浓度值。 如果样品被稀释,通过上述方法测的的浓度值,要乘以稀释倍数,才是样品的最终浓度 【检验方法的局限性】 1、仅供科研使用,不得用于临床诊断。 2、在试剂盒标示的有效期内使用,过期产品不得使用。 3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。 4、使用试剂盒配套的样品稀释液。 5、如果样本值高于标准曲线最高浓度,请用检测缓冲液稀释样本,并重新检测。如果细胞培养上清样本需要较大的稀释倍数,请用细胞培养基进行适度稀释。 6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果,检测前,请排除该因素。 7、通过其他方法得到的检测结果,与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。 【产品性能指标】 1、物理性能 试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装,无破损漏气。 2、剂量反应曲线线性 校准品剂量反应曲线相关系数r值,大于等于0.9900。 3、精密度 批内精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。 批间精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。 4、灵敏度 最低检出剂量小于3.2pg/ml。 5、回收率 三组已知的高、中、低浓度样品,进行五次回收率评估,回收率在85%-115%之间。 6、特异性 本试剂盒识别天然和重组人α-干扰素(IFN-α),与结构类似物无交叉。 稳定性 2℃-8℃保存,有效期6个月。 【注意事项】 生物安全 1、检测必须符合实验室管理规范的规定,严格防止交叉污染,所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。 2、试剂盒的液体组分中,含有proclin-300防腐剂,可能引起皮肤过敏反应,避免吸入烟雾与皮肤接触。 3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用,避免吸入烟雾。戴上防护手套,实验完成后彻底洗手。 4、试剂盒中的终止液为酸性溶液,在使用终止液时,请佩戴防护服,及防护眼睛、手及面部的设施。 5、本试剂盒用于科学研究,不能用于诊断治疗。 6、请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。 技术要点 1、重溶或者混合蛋白溶液时,避免起泡。 2、加标准品与样本时,每个标准品浓度和样本都要更换移液枪头,公共组分应该悬臂加样,避免交叉污染。 3、合适的温育时间,和充分的洗涤步骤,是保证实验结果准确性的必要条件。 4、底物溶液为无色液体,保存过程中变为蓝色,代表底物溶液已经失效,不得使用。 5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致,加入终止液后,蓝色底物产物,会瞬间变为黄色。 6、实验中,用剩的板条,应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。 7、所有液体组分,使用前充分摇匀,严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。 废物处理 所有使用或未使用的试剂,所有污染性的一次性材料,应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序,每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别,进行废物和污物的处理,同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。