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  • 如何通过体外哺乳动物细胞染色体畸变试验报告?

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  • 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验上海飞凡出具权威报告。上海飞凡检测认证中心,国家认可一站式体外哺乳动物细胞染色体畸变试验检测服务机构,24小时免费服务热线:4007726386 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3 试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变,以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration):染色体结构损伤,表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration):染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration):所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration):在细胞分裂的中期相阶段,用显微镜检出的染色体结构改变,表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index):中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值;是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙胺)处理,使细胞停止在中期分裂相,随后收获细胞,制片,染色,分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物,阳性对照物应是已知的断裂剂,能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时,可使用甲磺酸甲酯(methyl methanesulphonate (MMS))、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate(EMS))、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)。当外源性活化系统存在时,可使用苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物:应设阴性对照,即仅含和受试物组相同的溶剂,不含受试物,其它处理和受试物组完全相同。此外,如未能证实所选溶剂不具有致突变性,溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异,还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制:固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中,用前稀释至适合浓度;液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制,否则就必须证实贮存不影响其稳定性。 6.1.3.2 溶剂的选择:溶剂必须是非致突变物,不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。可以选择]溶剂是培养液(不含血清)或水。二甲基亚砜(DMSO)也是常用溶剂,使用时浓度不应大于0.5%。 6.1.3.3 受试物浓度设置 (1) 高浓度的选择:决定高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶 解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。 (2) 细胞毒性的确定:应使用指示细胞完整性和生长情况的指标,在活化系统存在 或不存在的两种条件下确定细胞毒性,例如细胞覆盖程度(degree of confluency)、存活细胞计数(viable cell counts)或有丝分裂指数(mitotic index)。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。 (3) 剂量设置:①至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时,其浓度范 围应包括从大毒性至几乎无毒性;通常浓度间隔系数不大于 2 ~10。 ②在收获细胞时,高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计 数或有丝分裂指数(均应大于50%)。 ③对于那些相对无细胞毒性的化合物,高浓度应是5μl/mL, 5mg/mL或0.01mol/L。 ④对于相对不溶解的物质,当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性, 则高剂量应是,当处理期结束时,在终培养液中溶解度限 值以上的一个浓度。在某些情况下(即仅当高于低不溶解浓 度时才发生细胞毒性),应使用一个以上可看见沉淀的浓度。 好在试验处理开始和结束时均评价溶解度,因为由于细胞、S9 等的存在,在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化。不溶 解性可用肉眼鉴别,但沉淀不能影响观察。 6.1.4 培养液:采用MEM(Eagle),并加入非必需氨基酸和抗菌素(青、链霉素,按100IU/mL),胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可选用其它合适的培养液。 6.1.5 活化系统 通常使用的是S9混合物(S9 mix)。S9是从经酶诱导剂(Aroclor 1254或苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合使用)处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同Ames试验。S9的使用浓度为1%~10%(终浓度)。S9 mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定,但需对S9mix的活性进行鉴定,必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述 S9 0.125ml MgC12 (0.4 mol/L) 0.02 ml KC1(1.65mol/L) 0.02 ml 葡萄糖-6-磷酸 1.791mg 辅酶Ⅱ(氧化型,NADP) 3.0615mg 用无血清MEM培养液补足至1mL. 6.2 试验步骤 6.2.1 细胞:使用中国地鼠卵巢(CHO)细胞株或中国地鼠肺(CHL)细胞株。 6.2.2 试验时,应同时设阳性对照物,阴性对照物和至少3个可供分析的受试物浓度组。 6.2.3 试验前一天,将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中,放CO2培养箱内培养。 6.2.4 试验需在加入和不加入S9 mix的条件下进行。试验时,吸去培养皿(瓶)中的培养液,加入一定浓度的受试物、S9 mix(不加S9 mix时,需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液,放培养箱中处理2h~6h。结束后,吸去含受试物的培养液,用Hanks液洗细胞3次,加入含10%胎牛血清的培养液,放回培养箱,于24h内收获细胞。于收获前2h~4h,加入细胞分裂中期阻断剂(如用秋水仙素,作用时间为4h,终浓度为1μg/mL)。 当受试物为原料时, 如果在上述加入和不加入S9 mix的条件下均获得阴性结果,则尚需补加另外的试验,即在不加S9 mix的条件下,使受试物与试验系统的接触时间延长至24h。 当难以得出明确结论时,应更换试验条件,如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。 6.2.5 收获细胞时,用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞脱落后,加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用,混匀,放入离心管以1000r/min~1200r/min的速度离心5min~7min,弃去上清液,加入0.075mol/L KC1溶液低渗处理,继而以新配制的甲醇和冰醋酸液(容积比为3:1)进行固定。按常规制片,用姬姆萨染液染色。 6.2.6 作染色体分析时,对每一处理组选200个(阳性对照可选100个)分散良好的中期分裂相(染色体数为2n±2)进行染色体畸变分析。在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目,对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。 6.3 统计处理:对染色体畸变细胞率用X2检验,以评价受试物的致突变性。 6.4 结果评价:在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性: (1)受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义,并有与剂量相关的增加。 (2)受试物在任何一个剂量条件下,引起具有统计学意义,并有可重复性的阳性反应。 在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。 7 试验报告 试验报告应包括以下内容: (1)受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择(应说明受试物对细胞毒 性的测定方法、溶解情况等); (2)细胞株名称; (3)实验条件和方法 ①代谢活化系统:制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方; ②对照物:阳性对照物名称和选用浓度;阴性(溶剂)对照物名称及使用浓度。 ③培养液:所用培养液名称、血清类别和使用浓度; ④接种时的细胞密度以及所用培养皿(瓶)的规格; ⑤中期分裂阻断剂:名称、所用浓度、作用时间; ⑥处理时间:受试物与试验系统的接触时间; ⑦简述制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法。 (4)结果 ①受试物高剂量的确定及试验结果:细胞毒性的测定(建议的表格见表1);溶解情况 (建议的表格见表2);对pH和渗克分子(osmolality)浓度的影响(如果有影响)。 ②各处理组和对照组染色体畸变率(建议的表格见表3)。 ③本实验室的阳性对照组和阴性对照组(常用溶剂,如DMSO)在本实验室历史上的染 色体畸变率范围、均值和标准差(说明样品数)。 (5)结论。 涉及地区:广东省、浙江省、福建省、海南省、云南省、广西省、贵州省、新疆省、四川省、重庆市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江苏省、甘肃省、宁夏省、内蒙古省、黑龙江省、吉林省、辽宁省、山东省、陕西省、山西省、河南省、河北省


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