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透射电镜的样品如何制备?

http://www.testrust.com 来源:检测通 时间:2017-04-21

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  透射电镜样品制备方法

  样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜,然后按下列步骤处理样品:

  倒掉固定液,用0.1M,pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;

  用1%的锇酸溶液固定样品1-2h;

  倒掉固定液,用0.1M,pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;

  用梯度浓度(包括50%,70%,80%,90%和95%五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用100%的乙醇处理一次,每次20min;最后过度到纯丙酮处理20min;

  用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1/1)处理样品1h;

  用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3/1)处理样品3h;

  纯包埋剂处理样品过夜;

  将经过渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜,即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片,获得70-90nm的切片,该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min,即可在透射电镜中观察。

  TEM样品包埋块制作有关注意事项

  一、取材:

  1、动作迅速:组织离体后,应将其快速放入固定液中,使组织细胞尽可能保持原来的生活状态;

  2、减少损伤:选择锋利切割器械,减少牵拉或挤压组织;

  3、组织块大小:一般要小于1mm3。

  二、固定:

  固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程,目的是尽可能保持细胞的原有生活状态,不发生位移,减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。

  1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面,应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中

  2、使用锇酸的注意事项

  (1)通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液,使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。

  (2)锇酸为剧毒、极易挥发的试剂,必须在通风橱中操作,废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学,请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。

  三、漂洗:

  应彻底漂洗干净,减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。

  四、脱水:

  脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂,只有将生物组织中的游离水清除干净,包埋剂才能浸入组织。

  脱水过程中应注意:

  (1)逐级脱水而不能急剧脱水;

  (2)更换溶液时动作要快,特别是不要让组织离开溶液,否则会在组织内外产生气泡;

  (3)脱水过程中若要长时间停留或过夜,应放在70%脱水剂中,并在4℃保存。

  五、渗透

  渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂,使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。

  包埋剂配制及使用过程中的注意事项:

  (1)所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的;

  (2)配制过程中应搅拌均匀,使用过程中应避免异物,特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂;

  (3)配制好的包埋剂应密封保存,避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中,延长其使用期。

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