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微平科技微平台助力科研 www.weipingtest.cn/wpt 自主开发单糖检测方法 多糖中单糖组成的测定（PMP衍生法，适用还原性单糖） 一.  试剂配制 (1) 2mol/L 三氟乙酸(TFA)水溶液： (2) 0.3 mol/L NaOH (3) 0.3 mol/L HCl (4) 0.5 mol/L PMP甲醇溶液:称取0.4355g PMP用甲醇溶解,定容至5 mL (5) 单糖混合标准液: 各单糖质量浓度均为0.4mg/mL左右，水溶。使用时将之与0.6 mol/L NaOH 1:1混合再进行衍生。 二.  多糖水解 量取5mL样品于10 mL的钳口瓶中 , 加入1mL的TFA （TFA浓度约为2mol/L ）, 充 N2封管 , 110 ℃烘箱中水解6H; 冷却后定容至10mL，取2mL加入一定量甲醇后,70℃水浴下用N2吹干,如此重复加甲醇并用N2吹干2次,以去除TFA; 加入1mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解残渣，为多糖水解液。 三.  单糖衍生化 分别取 400μL的混合单糖标准液或多糖水解液于 5 mL的具塞试管中 , 加 400μL PMP甲醇溶液 , 漩涡混匀; 于70℃水浴中反应2H; 取出放置冷却至室温;加400μL 0.3 mol/L的HCl中和（pH 6~7）;加水200μL , 再加等体积的氯仿，涡旋混匀振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取 2次。将水相用 0.45μm微孔膜(水系)过滤后供 HPLC进样分析。 四.  HPLC检测条件 仪器型号：agilent1100,配DAD检测器 色谱条件： 色谱柱C18柱，250mm*4.6mm，粒度5μm;流动相A：100mM 磷酸钠缓冲液（pH=6.5)；流动相B:乙腈;检测波长:250nm;柱温30℃;流速1ml/min;进样量5ul; 梯度洗脱 T/min A% B% 0 85 15 10 83 17 30 80 20 35 60 40 36 85 15 40 85 15