检测认证人脉交流通讯录
- 一、概要 硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用 用来检测呋喃西林代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫方法结合了色谱技术，采用SEM衍生物的特异性抗体，具有很高的精确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样品量大等特点在检测中很好的表现出来。 本试剂盒是应用ELISA技术研发而成的检测产品，能最大限度地减少操作误差和工作强度。二、试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被呋喃西林代谢物抗原，样品残留的呋喃西林代谢物和微孔条上预包被的抗原竞争抗呋喃西林代谢物抗体，加入酶标二抗后，经TMB底物显色，样品吸光度值与其残留物呋喃西林代谢物呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃西林代谢物的含量。三、适用范围可定性、定量检测动物组织（鸡、猪），蜂蜜样品中的呋喃西林代谢物的残留量。四、交叉反应率呋喃西林代谢物…………………………………… 100% 呋喃它酮代谢物…………………………………小于 0.1% 呋喃妥因代谢物 …………………………………小于 0.1% 呋喃唑酮代谢物………………………………………小于0.1% 五、使用单位需自备的设备及试剂设备： ┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm ┅┅振荡器 ┅┅涡旋仪 ┅┅离心机 ┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置 ┅┅天平：感量0.01g ┅┅刻度移液管：10ml ┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、50ml ┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、200ml～1000ml 多道 250ml 试剂： ┅┅乙酸乙酯(分析纯) ┅┅正己烷(分析纯) ┅┅甲醇(分析纯) ┅┅浓盐酸 ┅┅氢氧化钠(分析纯) ┅┅去离子水六、提供的材料与试剂组份名称 96T装量 48T装量 备注酶标板 96T 48T 其它各规格装量按比例增加或减少，具体装量以实物为准。标准品×6瓶* 1ml/瓶 0.5ml/瓶 高浓度标准品100ppb 1ml/瓶 0.5ml/瓶 呋喃西林代谢物抗试剂 6ml 3ml 呋喃西林代谢物酶标物 6ml 3ml 底物液A液 6ml 3ml 底物液B液 6ml 3ml 终止液 6ml 3ml 浓缩洗涤液(10×) 40ml 20ml 呋喃西林代谢物浓缩样品稀释液(2×) 40ml 20ml 10×衍生化试剂 1ml/瓶 0.5ml/瓶 *注：标准品浓度为0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb 七、溶液的配制配液1: 样品稀释液用去离子水将呋喃西林代谢物浓缩样品稀释液(2×)按1:1体积比进行稀释，即：1份呋喃西林代谢物浓缩样品稀释液(2×)+1份去离子水；用于提取样品的稀释，样品稀释液在4℃环境可保存一个月。配液2: 洗涤工作液用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按1:9体积比进行稀释，即：1份浓缩洗涤液(10×)+9份去离子水；用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。配液3: 1×衍生化试剂 将10×衍生化试剂用甲醇按1:9体积比进行稀释，即：1份10×衍生化试剂+9份甲醇，现配现用。配液4: 0.1M盐酸溶液 量取860ml/浓盐酸加入到盛有去离子水的容器中定容至100ml。配液5: 0.1M 氢氧化钠溶液 称取0.4g氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml。八、样品前处理步骤样品处理前须知：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。（c）未处理的样品冷冻保存。（d）处理后的样品可在2-8℃避光保存24h。肌肉、肝脏、蜂蜜组织前处理方法 ┅┅用均质器均质样品； ┅┅称取1.0±0.05g均质后的样品, 分别加入4ml 0.1M 盐酸溶液和100ml 1×衍生化试剂，用振荡器充分振荡2min； ┅┅在37 oC过夜孵育（大约16h）； ┅┅分别加入4ml 0.1M 氢氧化钠溶液和10ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s； ┅┅3000g以上，室温（20～25℃/68-77℉）离心5min； ┅┅取5ml乙酸乙酯相于50～60℃氮气流下吹干； ┅┅加入1ml样品稀释液和1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s ，充分混匀； ┅┅3000g以上，室温（20～25℃/68-77℉）离心5min； ┅┅除去上层有机相，取下层水相50µl用于分析。九、检测步骤测定前应须知： 1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。 2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。 3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。 4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。操作步骤： 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。 3、洗涤工作液在使用前也需回温。 4、编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。 5、加标准品/样本：加标准品/样本50ml/孔到对应的微孔中，再加入呋喃西林代谢物酶标物50ml/孔，再加入呋喃西林代谢物抗试剂50ul/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。 6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min。 8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。十、 结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，而定量判定用第2种方法。注意样品吸光值与其所含呋喃西林代谢物成负相关。 1、用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样品1的吸光度值为0.569，样品2的吸光度值为1.725，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.523；0.05ppb为2.217；0.15ppb为1.566；0.45ppb为0.842；1.35ppb为0.387；4.05ppb为0.145。则样品1的浓度范围是0.45ppb～1.35ppb；样品2的浓度范围是0.05ppb～0.15ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中呋喃西林代谢物的浓度范围。 2、定量分析（1）百分吸光率的计算，标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 B—标准品或样品溶液的平均吸光度值 B0—0(ppb)标准品的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃西林代谢物标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲呋喃西林样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中呋喃西林代谢物实际残留量。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。 样品的稀释倍数：肌肉、肝脏组织、蜂蜜样品稀释倍数：2 十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度：0.05ppb 检测限：组织、蜂蜜…………………………………0.1ppb 回收率：水产、肌肉、肝脏、 蜂蜜 ………………………… 75±10% 精密度：试剂盒的变异系数均小于10% 十二、注意事项 1、室温低于20℃或试剂及样品没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、每加一种试剂前需将其摇匀。 4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 6、储存条件 保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 7、试剂变质的迹象 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。 8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15～20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到25min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。 9、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。十三、贮藏条件及保存期 贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。保存期：该产品有效期为12个月。 1盒96捆，最多可测90个样本。
