鱼类的急性毒性实验

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  鱼类急性毒性试验，是水生生态毒理学的重要内容之一，并广泛应用于水域环境污染监测工作中，对控制工业废水的排放、保护水域环境、发展渔业生产，制定渔业水质标准，具有重要意义。

一、实验原理

鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。

二、实验材料

1、试验用鱼的选择与驯养

试验用的鱼必须对毒物敏感，应具有代表性，便于在实验条件下饲养，来源丰富，个体健康。我国可采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼等。

在同一实验中要求试验鱼必须同属、同种、同龄，最好是当年生。鱼的平均体长以7cm以下为宜。金鱼体短、身宽，一般以3cm以下较为合适。同组鱼中最大的体长不应超过最小的体长的1.5倍。

选用的试验鱼在试验前必须在实验室内经过驯养，使之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。驯养鱼应该与试验相同水质水温的水体中至少驯养7天，使其适应试验环境，不应长期养殖（<2个月）。驯养期间，应每天换水，可每天喂食1～2次，但在试验前一天应停止喂食，以免试验时，剩余饵料及粪便影响水质。驯养期间试验鱼死亡率不得超过5%，否则，可以认为这批鱼不符合试验鱼的要求，应该继续驯养或者重新更换试验鱼进行驯养。

试验前必须挑选健康的鱼，即选择行动活泼、体色光泽、鱼鳍舒展完整、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都不得作试验鱼。

2、实验仪器设备

（1）实验容器

实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水族箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g），或者其盛水量以每条鱼2～3L为宜。一些小型鱼类幼鱼可选择500mL或1000mL烧杯为实验容器。容器的深度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所有毒性残留物。

（2）其他

溶解氧测定仪、水硬度计、温度控制仪、pH计、分析天平。

3、实验用水（稀释水）及水质条件

用来驯养和配制实验液的水，必须是未受污染的清洁水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需过滤以除去大的悬浮物质。也可用放置3天以上的自来水。如果试验目的是评价工业废水或化学物质对接纳水体的影响时，则最好采用接纳水体的污染源上游水作为试验用稀释水。蒸馏水不适合作稀释水，因为蒸馏水中已除去了自然界水中的盐类，与实际差距太大，另外由于蒸馏器的影响，有时使蒸馏水中带有对鱼类不利的金属离子，影响试验结果。

实验用水的水质条件一般是指水的温度、pH、溶解氧、硬度、水中的有机物和水量等。

（1）水温

实验中应保持鱼类原来的适应温度，一般冷水鱼温度为12～18，温水鱼温度为20～28。为使得实验结果可靠，在同一实验中，温度的波动范围不要超过4（即±2）。冬天可以通过加热室内的空气温度达到调节水温的目的，也可以采用电热棒直接控制调节水温。

（2）pH

水的pH与水生生物的代谢作用有密切关系。对毒物的毒性作用也有一定的影响。因此，在实验中应维持pH在鱼类适宜范围内。一般实验液的pH在6.7～8.5为宜。如需调节pH，可用1M或0.1M的HCl和NaOH来调节受试物贮备液的pH。调节贮备液的pH时不能使受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。

（3）溶解氧

溶解氧是鱼类生存的必要条件，它能影响鱼类对毒物的敏感性。一般温水鱼要求溶解氧在4mg/L以上，冷水鱼要求溶解氧在5mg/L以上。

（4）硬度

水的总硬度为10～250mg/L（以CaCO₃计）。

三、实验步骤

1、预试验

用确定正式实验所需浓度范围，可选择较大范围的浓度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L、0.1mg/L。每个浓度放入5条鱼，可用静态方式进行，不设平等组，试验持续48h～96h。每天至少两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼。求出24h100%死亡浓度和96h无死亡浓度。

如果依次预试验结果无法确定正式试验所需的浓度范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。

2、正式实验

根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最低浓度和96h鱼类全部存活的最好浓度之间至少设置5个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应≤2.2。

每个试验浓度组应至少设2～3个平行，每一系列设一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照组，其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。试验鱼的数目以每组实验浓度10～20尾合适，不得少于10尾。

试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随机取出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当的鱼均应弃除。同一试验，所有试验用鱼应30min内分组完毕。

在24h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反应等，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。应在试验开始后3h或6h观察各处理组鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积等）。

试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期间，每天至少测定一次。

至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的受试物浓度。

试验结束时，对照组的死亡率不得超过10%。

四、实验报告

1、数据处理

以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序计算出24h、48h、72h、96h的半致死浓度（LC₅₀）值，并计算95%的置信限。

如果试验数据不适于计算LC₅₀，可用不引起死亡的最高浓度和引起100%死亡的最低死亡浓度估算LC₅₀的近似值，即这两个浓度的几何平均值（）。

2、化学物质急性毒性分级

依据LC50值的大小，可以将化学物质的急性毒性分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级。

鱼类急性毒性实验毒性分级标准

3、编写报告

在实验报告中应包括：试验名称、目的、试验原理、试验的准确起止日期，还有如下几项：

（1）试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯化状况。

（2）受试物质名称、来源物化学性质和保存方法。

（3）实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。

（4）实验溶液的浓度与配制方法、实验温度。

（5）实验条件，如容器形式、实验液的体积与深度、受试生物数目及负荷率。

（6）实验开始后24h、48h、72h、96h时的LC₅₀值，及其毒性分级。

4、注意事项

（1）试验期间，对照组鱼死亡率不得超过10%。

（2）试验期间，受试物实测浓度不能低于设置浓度的80%。如果试验期间受试物实测浓度与设置浓度相差超过20%，则应该以实测受试物浓度来表达试验结果。

（3）试验期间，尽可能维持恒定条件。