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1   外周血白细胞计数实验     1.1 原理     外周血白细胞数减少是一次性全身  γ  射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与外周  血中白细胞数成反比，恢复时间与外周血中白细胞数成正比，外周血中白细胞数可代表血液系统受损的状  况。具有辐射危害辅助保护作用的受试物对受辐射损伤机体的血液系统具有防护作用。     1.2 仪器和试剂     20μL 定量取血管、血球计数板、显微镜、 1%  盐酸等。     1.3 实验方法     1.3.1   实验动物：小鼠， 18 － 22g ，单一性别，每组 10 － 15 只。     1.3.2   剂量分组及受试样品给予时间     实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的 10 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，  必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予 14 － 30 天，照射后仍然给予受试物，必要时可延长至 45 天。     1.3.3   实验步骤     受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量  γ  射线全身照射一  次，照射剂量宜选择 3Gy － 5Gy 。分别于照射前、照射后第 3 天、照射后第 14 天三次采末梢血 20μL ，加入 0.38mL 1 ％盐酸中，混匀后，加入血球计数板中，计算计数池中四个大方格中白细胞总数。                              四个大方格中白细胞总数     白细胞数（ 10 9 /L ） = -------------------------×  稀释倍数     × 10 7                                      4       1.4   数据处理及结果判定     白细胞数为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值， F 值 < F 0.05 , 结论：各组均数间差异无显著性； F 值  ≥F 0.05 ,P≤0.05, 用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较  方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后  的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。     照射前的外周血白细胞计数，用于各组间白细胞数目的均衡性检验，剂量组与辐射模型对照组比较，差异  无显著性，再进行照射及后续实验。     照射后 3 天、 14 天辐射模型对照组的白细胞数分别与照射前进行自身比较，差异有显著性，则判定辐射损  伤模型成立；任一时间点、任一剂量组与辐射模型对照组比较，白细胞总数增多，差异有显著性，则可判  定该实验阳性。     2 ．骨髓细胞 DNA  含量或骨髓有核细胞数实验     2.1 原理     骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数降低是一次性全身  γ  射线照射引起辐射损伤的表现之一，  在一定范围  内，照射剂量与骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数成反比，恢复时间与骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核  细胞数成正比，骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数可代表造血系统受损的状况。具有辐射危害辅助保  护作用的受试物对受辐射损伤机体的造血系统具有防护作用。     2.2 仪器和试剂     血球计数板、显微镜、注射器、手术器械、紫外分光光度计、 Hank’s 液等。     2.3 实验方法     2.3.1   实验动物：小鼠， 18 － 22g ，单一性别，每组 10 － 15 只。     2.3.2 剂量分组及受试样品给予时间 

实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。 2.3.3 实验步骤

受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择3Gy－5Gy。于照射后第3天，颈椎脱臼杀死小白鼠，剥离出股骨，用1mL注射器（6.5号针头）吸取一定体积的Hank’s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞；最后，让细胞悬液通过4号针头的注射器，使细胞在悬液中充分分散。

镜下计数每mL骨髓细胞悬液中的有核细胞数。 或用紫外分光光度计260nm处测定DNA含量。 2.4 数据处理及结果判定

骨髓有核细胞数或骨髓细胞DNA含量为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

辐射模型对照组与阴性对照组骨髓有核细胞数或骨髓细胞DNA含量进行两样本均数的成组双侧t或t’检验，差异具有显著性，则判定辐射损伤模型成立。

任一剂量组与辐射模型对照组比较，骨髓有核细胞数或骨髓细胞DNA含量增多，差异有显著性，则可判定该实验阳性。 3.小鼠骨髓细胞微核实验 3.1 原理

骨髓细胞微核数增高是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与骨髓细胞微核率成正比，恢复时间与骨髓细胞微核率成反比，骨髓细胞微核数可代表机体染色体受损的状况。具有辐射危害辅助保护作用的受试物对受辐射损伤机体的遗传系统具有防护作用。 3.2 仪器和试剂

解剖器械，生物显微镜，载玻片等。

小牛血清：小牛血清滤菌后放入56℃恒温水浴保温1h进行补体活性灭活。－20℃保存。亦可用大、小鼠血清代替。

Giemsa染液及应用液

1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.8） 甲醇（分析纯） 3.3 实验方法

3.3.1 实验动物：小鼠，体重18－22g，单一性别，每组10－15只。 3.3.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

3.3.3 实验步骤：

受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择3Gy－5Gy。于照射后第3天，颈椎脱臼处死动物，取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5－10min，放入Giemsa应用液中，染色10－15min，立即用磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗，晾干。镜检，每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以千分率表示。

抑制率计算：              C－D

A（％）＝────── ×100％              C－E 式中 A－抑制率

     C－致突变物对照组微核率      D－受试样品组微核率      E －阴性对照组微核率 3.4 数据处理及结果判定

采用卡方检验、泊松分布或方差分析等统计方法进行数据处理。

辐射模型对照组与阴性对照组骨髓细胞微核率进行两样本均数的成组双侧t或t’检验，差异具有显著性，则判定辐射损伤模型成立。

任一剂量组微核率低于辐射模型对照组微核率，差异有显著性，可判定该实验结果阳性。 

4.血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性实验 4.1 原理

血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性成反比，恢复时间与血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性成正比，血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性可代表机体氧化还原反应系统受损的状况。具有辐射危害辅助保护作用的受试物对受辐射损伤机体的氧化还原系统具有防护作用。

O2－氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2－

后形成的亚硝酸盐减少。 4.2仪器与试剂

仪器 721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器 试剂

    65mM磷酸盐缓冲液(PBS) pH7.8、SOD标准品、三氯甲烷、95％乙醇(v/v)、0.9%生理盐水 10mmol/L盐酸羟胺

         盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL 7.5mmol/L黄嘌呤

         黄嘌呤11.41mg，加0.1M NaOH 2.5mL溶解，加PBS至10mL 0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶

         取10mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL 0.1%甲萘胺

取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL凉蒸馏水至200mL 0.33%对氨基苯磺酸

取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL 4.3 实验方法

4.3.1 实验动物：小鼠，体重18－22g，单一性别，每组10－15只。 4.3.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。 4.3.3实验步骤