动物源性食品中氯霉素类药物

　　残留量测定

　　1范围

　　本标准规定了动物源性食品中氯霉素类残留量的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱/质谱测定 方法。

　　本标准适用于水产品、畜禽产品和畜禽副产品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留的定性确证和 定量测定。

　　2气相色谱-质谱法

　　2. 1原理

　　样品用乙酸乙酯提取,4%氯化钠溶液和正己烷液-液分配净化，再经弗罗里硅土(Florisil)柱净化 后，以甲苯为反应介质，用N，0双(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(BSTFA + TMCS，" + 1) 于70 X：硅烷化，用气相色谱/负化学电离源质谱测定，内标工作曲线法定量。

　　2.2试剂和材料

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和二次去离子水或相当纯度的水。

　　2.2.1甲醇：色谱纯。

　　2.2.2甲苯:农残级。

　　2.2.3正己烷:农残级。

　　2.2.4乙酸乙酯。

　　2.2.5 乙醚。

　　2.2.6氯化钠。

　　2. 2. 7氣霉素(CAP)、氟甲砜霉素(FF)、甲砜霉素(TAP)标准物质:纯度>99%。

　　2. 2. 8间硝基氯霉素(m-CAP)标准物质:纯度>99%。

　　2. 2. 9氯化钠溶液(4%):称取适量氣化钠用水配置成4%的氣化钠溶液，常温保存，可使用1周。

　　2.2. 10氯霉素类标准储备溶液：准确称取适量氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素标准物质(精确到 0.1 mg)，以甲醇配制成浓度为1〇〇 Pg/mL的标准储备溶液。

　　2.2.11间硝基氯霉素内标工作溶液:准确称取适量间硝基氯霉素标准物质(精确到〇• 1 mg)，用甲醇 配制成1〇 ng/mL的标准工作溶液。

　　2.2. 12氯霉素类基质标准工作溶液:选择不含氯霉素类的样品六份，分别添加1 mL内标工作溶液 (2.2. 11),用这六份提取液分别配成氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素浓度为0-1 ng/mL、0.2 ng/mL、 1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的溶液,按本方法提取(2. 4.1)、净化(2. 4. 2)，制成样品提取液， 用氮气缓慢吹干，硅烷化(2. 4. 3)后，制成标准工作溶液。

　　2.2. 13衍生化试剂：N，0双(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烧(BSTFA+TMCS，99+1)。 2.2.14固相萃取柱：弗罗里硅土柱(6.〇 mL，1.0 g)。

　　2.3仪器和设备

　　2.3. 1气相色谱/质谱联用仪:配有化学电离源(CI)。

　　2.3.2组织捣碎机。

　　2.3.3固相萃取装置。

　　2.3.4振荡器。

　　2.3.5旋转蒸发仪。

　　2.3.6涡旋混合器。

　　2.3.7离心机。

　　2.3.8恒温箱。

　　2.4测定步骤

　　2.4. 1提取

　　称取10 g(精确到0. 01 g)粉碎的组织样品于50 mL具塞离心管中，加人1. 〇 mL内标溶液 (2. 2. 11)和30 mL乙酸乙酯，振荡30 min，于4 000 r/min离心2 min，上层清液转移至圆底烧瓶中，残 渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液,35 °C旋转蒸发至1 mL〜2 mL，待净化。

　　2.4.2 净化

　　2.4.2. 1液-液萃取

　　提取液浓缩物(2.4. 1)加1 mL甲醇溶解，用20 mL氯化钠溶液(2. 2. 9)和20 mL正己烷液-液萃 取，弃去正己烷层，水相用40 mL乙酸乙酯分两次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35 旋转蒸发至 近干，用氮气缓慢吹干。

　　2. 4. 2. 2弗罗里硅土柱净化

　　弗罗里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇-乙醚(3 + 7)溶液和5 mL乙醚淋洗备用。将残渣 (2.4.2.1)用5.0 mL乙醚溶解上样，用5.0 mL乙醚淋洗Florisil柱，5.0 mL甲醇-乙醚溶液(3 + 7)洗 脱，洗脱液用氮气缓慢吹干，待硅烷化。

　　2.4.3硅烷化

　　净化后的试样(2. 4. 2. 2)用0. 2 mL甲苯溶解，加入〇• 1 mL硅烷化试剂(2. 2. 13)混合，于70 X：衍

　　生化60 min。氮气缓慢吹干，用1.0 mL正己烷定容，待测定。

　　2.4.4测定

　　2.4.4.1气相色谱-质谱条件

　　a) 色谱柱:DB-5MS毛细管柱，30 mX0.25 mm (内径)X0.25 /rni，或与之相当者;

　　b) 色谱柱温度:50 t;保持1 min，25 t：/min升至280 保持5 min;

　　c) 进样口温度：250 t;

　　d) 进样方式:不分流进样，不分流时间〇. 75 min;

　　e) 载气:高纯氮气，纯度>99. 999%;

　　f) 流速：1. 0 mL/min;

　　g) 进样量:l.〇nL;

　　h) 接口温度JSOt：;

　　i) 离子源:化学电离源负离子模式NCI;

　　j) 扫描方式:选择离子监测;

　　k) 离子源温度：15〇X：;

　　l) 四级杆温度：106X：;

　　m) 反应气：甲烷，纯度>99. 999%;

　　n) 选择监测离子参见表1。

　2. 4. 4. 2定性测定

　　进行试样测定时，如果检出色谱峰的保留时间与标准物质相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图 中，所选择的离子均出现，而且所选择离子的相对离子丰度比与标准物质一致，相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中存在对应的三种氯霉素。如果不能确证，应重新进样，以扫描方式 (有足够灵敏度)或采用增加其他确证离子的方式来确证。

　　2. 4. 4. 3内标工作曲线

　　用配制的基质标准工作溶液(2. 2.12)按2.4.4. 1的气相色谱-质谱条件分别进样，以标准溶液浓度 为横坐标，待测组分与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制内标工作曲线。

　　2. 4. 4. 4 定置

　　以mM66(m-CAP和CAP)、339(FF)和409(TAP)为定量离子，样品溶液中氯霉素类衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下(2. 4. 4. 1)，m-CAP、CAP、FF、TAP标准物质 衍生物参考保留时间约为11. 4 min、ll. 8 min、12. 6 min、13. 6 min。氯霉素类标准物质衍生物总离子 流图和质谱图参见附录A中的图A. 1和图A. 2。

　　2.4.5平行实验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

　　2.4.6空白实验

　　除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

　　2.5结果计算

　　结果按式(1)计算：

　　X = .................. ( 1 )

　　式中：

　　X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(Mg/kg); c——从内标标准工作曲线上得到的被测组分浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);

　　V——试样溶液定容体积，单位为毫升(mL); m——试样的质量，单位为克(g)。

　　GB/T 22338—2008 2.6测定低限

　　气相色谱-质谱测定低限为:氯霉素0.1 yg/kg，氟甲砜霉素和甲砜霉素〇.5 Mg/kg。

　　2.7回收率和精密度

　　参见附录B。

　　3液相色谱-质谱/质谱法 3. 1原理

　　针对不同动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留，分别采用乙腈、乙酸乙酯-乙醚或乙 酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱进行净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，氯霉素采用内标法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外标法定量。

　　3.2试剂和材料

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和二次去离子水或相当纯度的水。

　　3.2. 1甲醇:液相色谱级。

　　3.2.2乙腈:液相色谱级。

　　3.2.3丙酮:液相色谱级。

　　3.2.4正丙醇:液相色谱级。

　　3.2.5正己烷:液相色谱级。

　　3.2.6乙酸乙酯:液相色谱级。

　　3.2.7乙醚。

　　3.2.8乙酸钠。

　　3.2.9乙酸铵。

　　3.2. 10斤葡萄糖醛酸苷酶:约40 000活性单位。

　　3_2. 11乙腈饱和正己院：取200 mL正己院(3. 2.5)于250 mL分液漏斗中，加入少量乙腈(3.2.2),剧烈振摇，静置分层后，弃去下层乙腈层即得。

　　3.2. 12丙酮-正己烷(1 + 9):丙酮(3. 2. 3)、正己烷(3. 2.5)按体积比1 : 9混匀。

　　3. 2. 13丙酮-正己烷(6+4):丙酮(3. 2. 3)、正己烷(3. 2. 5)按体积比6 : 4混匀。

　　3.2. 14乙酸乙酯-乙醚(75+25):75 1111^乙酸乙酯(3.2.6)与25 1111^乙醚(3.2.7)溶液混匀。

　　3.2. 15乙酸钠缓冲液(0_ 1 mol/L):称取乙酸钠(3. 2. 8)13. 6 g于1 000 mL容量瓶中，加入980 mL

　　水溶解并混匀，用乙酸调pH到5.0,定容至刻度混匀。

　　3.2. 16乙酸铵溶液(10 mmol/L):称取乙酸铵(3. 2. 9)0. 77 g于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度混匀。

　　3.2. 17氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质:纯度>99.0%。

　　3.2. 18氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)物质:纯度>99. 9%。

　　3.2. 19标准储备溶液:分别准确称取适量的氯霉素、甲讽霉素和氟甲讽霉素标准物质(3. 2. 17)(精确 到0.1 mg),用乙腈配成5〇0 fig/mL的标准储备溶液(4 °C避光保存可使用6个月)。

　　3.2.20氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液:分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准储备溶液(3.2.19)，用乙腈稀释成50 fxg/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液(4 X：避光保存可使用3个月)。

　　3.2.21氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准工作溶液:分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液(3. 2. 20)，用流动相稀释成合适的混合标准工作溶液(现用现配)。

　　3.2.22氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)储备溶液:准确称取适量的氯霉素-d5标准物质(3. 2.18)(精确到0• 1 mg)，用乙腈配成100 fzg/mL的标准储备溶液(4 ^避光保存可使用12个月)。

　　3.2.23氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)中间溶液:准确移取适量的氯霉素-d5储备溶液(3. 2. 22)，用乙

　　4

　　腈配成1 Mg/mL内标中间溶液(4 °C避光保存可使用6个月)。

　　3.2.24氯霉素氘代内标(氯霉素-D5)工作溶液：准确移取适量的氯霉素-D5中间溶液(3. 2. 23)，用乙 腈配成〇• 1 Hg/mL内标工作溶液(4 °C避光保存可使用2周)。

　　3.2.25 LC-Si固相萃取柱或相当者:200 mg，3mL。

　　3.2.26 EN固相萃取柱或相当者:200 mg，3mL。

　　3.2.27 —次性注射式滤器:配有0.45 微孔滤膜。

　　3.3仪器和设备

　　3.3.1液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源。

　　3.3.2高速组织捣碎机。

　　3.3.3均质器。

　　3.3.4旋转蒸发仪。

　　3.3.5分析天平。

　　3.3.6 移液枪:20〇ML、lmLD 3.3.7心形瓶:100mL，棕色。

　　3.3.8分液漏斗：200 mL。

　　3.3.9聚四氟乙烯离心管：50mL。

　　3. 3. 10离心机。

　　3.3.11涡旋混合器。

　　3.3.12固相萃取装置。

　　3.4试样制备与保存 3.4.1试样的制备

　　从原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎或混匀，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作为试样，一份作为留样。

　　3.4.2试样的保存

　　试样应在一20 t条件下保存。

　　3.5测定步骤

　　3.5. 1提取

　　3.5. 1. 1动物组织(肝、肾除外)与水产品

　　称取试样5 g(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中，加入100 氯霉素氘代内标(氯霉素-05)工

　　作溶液(3.2. 24)和30 mL乙腈，匀浆，离心5 min。将上清液移人250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈 饱和的正己烷(3. 2. 11)，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至100 mL棕色心形瓶中。残渣中再加入 30 mL乙腈，振摇3 min,离心5 min，取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min,静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40 °C水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加 5 mL丙酮-正己烷(3. 2.12)溶解残渣。

　　3.5. 1.2动物肝、肾组织

　　称取试样5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加人30 mL乙酸钠缓冲液(3. 2. 15)，均质 2 min，加人300吣泠葡萄糖醛酸苷酶(3. 2. 10)，于37 °C温育过夜。消解样品中加人100 氯霉素氘

　　代内标(氯霉素-D5)工作溶液(3. 2. 24) ,20 mL乙酸乙酯-乙醚(3. 2. 14),振摇2 min,离心5 min。取上 层有机层人心形瓶中，在40 C水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5 mL丙酮-正己烷(3. 2. 12)溶解 残渣。

　　3.5. 1.3 蜂蜜

　　称取蜂蜜试样5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入100 /^氯霉素氘代内标(氯霉素- D5)工作溶液(3. 2.24)，5 mL水，混匀，再加人20 mL乙酸乙酯，振摇2 min,离心5 min，移取有机层到

　　100 mL棕色心形瓶中，于离心管中再加人20 mL乙酸乙酯，振摇2 min,离心5 min,合并有机层于棕色心形瓶中，40 C水浴中旋转蒸发至干,3 mL水溶解残渣,混匀。

　　3.5.2净化

　　3.5.2. 1动物组织与水产品

　　用5 mL丙酮-正己烷(3. 2.12)淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液(3_ 5.1.1、3_ 5.1. 2) 转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5 mL丙酮-正己烷(3. 2.13)洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，4〇 ^水 浴中旋转蒸发至近干，氮气吹干，用1 mL水定容，定容液过〇• 45 /xm滤膜(3. 2. 27)至进样瓶，待测定。

　　3. 5. 2. 2 蜂蜜

　　分别用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，将提取液(3. 5. 1.3)转移上柱，用5 mL水淋涤， 用玻璃棒压干1 min,用3 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干，用1 mL水定容，定容液通过0.45 fim 滤膜(3. 2. 27)至进样瓶，待测定。

　　3.5.3液相色谱-质谱/质谱测定

　　3.5.3. 1液相色谱条件

　　a) 色谱柱：Zorbax SfrC18, 5/xm，2.1 mmXl50 mm，或与之相当者;

　　b) 流动相:水-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序参见表2;

3. 5. 3. 2质谱/质谱条件 参见附录C。

　　3. 5. 3. 3定性测定

　　按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶液的保留时间相比在允许偏差士2. 5%之内;待测化合物定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或 等于3(S/N>3)，定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于l〇(S/N>10);定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的目标 化合物。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准工作溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测(MRM) 总离子流图和重构离子色谱图以及各目标化合物相对保留时间参见附录D中图D. 1〜图D. 5和 表 D.1。

　　表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差

3. 5. 3. 4定量测定

　　氯霉素使用内标法定量;甲砜霉素和氟甲砜霉素使用外标法定量。

　　3.6结果计算

　　试样中目标化合物残留量使用仪器数据处理系统或氯霉素残留量按式(2)计算，甲砜霉素和氟甲砜

　　霉素按式(3)计算:

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