检测认证人脉交流通讯录
激酶抑制剂测试-激酶抑制剂检测方法详细介绍（一）
- 现在最经常使用的还是放射性同位素标记ATP与荧光标记(包括荧光偏振\荧光共轭能量转移\时间分辨荧光以及化学发光等)等检测方法。这些方法均以微孔板作为载体，具有试剂消耗量低，检测速度快，通量高的优点，成为较普遍应用的一些蛋白激酶检测方法。
1 放射性同位素标记ATP法
使用放射性同位素32P-ATP或者33P-ATP标记的ATP进行激酶活性检测，使用放射性同位素方法有诸多优点：它是直接检测的方法，放射性同位素的灵敏度很高，测试结果非常准确，被认为是蛋白激酶生化活性检测的“金标准”。因此，至今还有很多人继续使用放射性同位素作为检测激酶活性的方法。放射性同位素方法主要有膜过滤法和接近闪烁计数法两类。
1.1 膜过滤方法
在该方法中，激酶反应使得多肽产物被32P -ATP或者33P -ATP标记。该产物会结合在过滤膜上，而其他游离的放射性同位素则会被磷酸盐洗脱，从而不会干扰实际检测。其主要优势在于可以应用于激酶和多肽底物的检测上而不受其他条件的限制。该方法不需要对多肽底物进行任何标记和修饰，检测时也不会受到化合物的干扰。
然而，由于放射性同位素的使用以及繁复的清洗分离步骤，使得将其应用于一些大规模的高通量筛选受到极大限制。无论如何，膜过滤法由于其检测结果的可靠性，至今仍然作为激酶酶谱筛选的重要方法之一，譬如激酶筛选服务提供商HotSpotSM以及Millipore就一直使用该技术。
1.2 接近闪烁计数法(Scintillation proximity assay, SPA)
GE以及PerkinElmer公司开发了SPA，这是一种均相反应的技术，其优势在于仅仅需要依次加入不同种试剂并混匀，在反应规定时间后，即可进行检测读数。GE的SPA方法的原理是包含有闪烁液的微珠，能够被β颗粒或者旋转的电子激发而发光。这种激发只有当放射性同位素标记的分子和微珠结合在一起时才能发生，并可以被标准的闪烁计数仪或者以电荷耦合装置(Charge coupled device, CCD)成像为原理的设备，比如GE公司的LEADseekerTM记录下来。未结合的放射性同位素标记的分子由于距离不够接近，无法产生发射光。因此，不需要进行清洗步骤以消除未结合的放射性物质对实验结果的干扰。
放射性同位素方法有以下一些缺点：
(1)产生大量的放射性垃圾，对人体有一定的损害；
(2)放射性ATP的半衰期非常短，只有14天(32P)或者25天(33P)，因此需要经常订购新的同位素；
(3)放射性同位素的能量非常高，有比较明显的交叉干扰现象，较难应用于化合物的高通量或者超高通量筛选。
2 非均相非放射性同位素法
由于放射性同位素存在上述一些缺点，科学家们开发了众多的非放射性激酶检测方法，包括酶联免疫法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法、毛细管电泳等。
2.1 酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
ELISA作为经典的蛋白质定量方法，被广泛应用于各种测定场合。其基本原理是将反应液中的抗原或者抗体固定在固相载体上，再加入酶偶联的抗体或者抗抗体与之形成复合物，利用酶催化反应的信号值来体现反应液中抗原或抗体的量。Bhagwat等将化学发光与ELISA相结合筛选哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1/复合物2(mammalian target of rapamycin complex C1/C2, mTORC1/mTORC2)的激酶抑制剂。mTORC1催化4E-BP1磷酸化，磷酸化的4E-BP1可被专一性的抗磷酸化4E-BP1的抗体识别，并结合标记了辣根过氧化素酶的抗抗体，随后加入化学发光试剂并检测发光强度，以发光强度的大小反映酶活的高低。
ELISA法的优点是定量准确，信号值可以通过二级抗体或者亲和素-生物素系统放大，但操作较繁琐，且抗体的价格较为昂贵。
2.2 高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography, HPLC)
HPLC是利用底物或产物与其它成分性质不同而进行分离的方法，可根据待分离物质的性质，如极性、电荷、分子大小等等选择不同的色谱系统达到分离的目的。Salyan等建立了一种利用LC/MS法检测儿茶酚O甲基转移酶(catechol o-methyltransferase, COMT)活性的方法。利用大多数甲基转移酶的辅酶S-腺苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine, SAM)和产物S-腺苷高半胱氨酸(Sadenosylhomocysteine, SAH)在柱中保留时间的不同(分别是2.1和4.9 min)进行分离，再利用质谱法(Mass Spectrometry, MS)进行定性和定量。Li等在此基础上进一步优化了该方法，将每个样品的分离时间从1.2 min缩短为15 s，大大提高了检测的通量。
HPLC自动化程度高，可自动处理大量样品，进行数据处理；所需样品的体积小；较为方便、快捷；通用程度高，除了固定相和流动相之外，检测手段也很多样化，可满足多种的检测方式；具有高精确性、特异性、敏感性和可重复性。在实际应用中，HPLC往往是作为分离的手段，将HPLC与质谱法联用，利用后者进行定量研究。
2.3 质谱(Mass Spectrometry, MS)
与HPLC相比，质谱在定量和定性的研究上更加广泛。质谱检测的原理是利用样品在离子源中，因为结构性质的差别被电离为不同质荷比(m/z)的离子碎片，这些碎片在外加电磁场中被分离，分离的离子流依次通过检测器进行检测，再经过放大器将信号值放大，最后被电脑绘制成图，得到一个以m/z为横坐标，离子丰度为纵坐标的棒图。质谱可以检测酶促反应过程中酶的结构改变，如酶的磷酸化或者与“自杀”底物的结合；可用于底物和产物的定性和定量，可同时研究所有的底物、产物和酶；可同时监测多个酶促反应的进行。
最常用于生物质谱分析的是电喷雾离子化(electrospray ionization, ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI)的方法。两者都属于软电离技术，可用于传统方法易碎的大分子，如多聚体的分析，并且使直接在溶液中分析样品成为了可能。但MALDI和ESI各自都有不足之处，MALDI由于待分析的晶体在基质里分布不均一，以及激光解析法带来的信号值不稳定，这种方法主要用来进行质量方面的检测，较少用于定量研究；ESI的通量较低，比较适合于中通量的分析，且这两种方法对样品纯度的要求都较高。
2.4 核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
NMR的原理是用无线电波(60 cm~300 m)照射分子时，原子核自旋能级的跃迁，由于局部抗磁屏蔽效应的存在，不同化学环境的原子核所吸收的频率不同，从而产生不同的化学位移。常见的NMR有氢谱、碳谱、氮谱等等。氢谱主要研究氢分布，碳谱研究碳骨架的信息，氮谱研究含氮有机物的信息。
化学水平的信息，比如质子化水平和杂交的程度对于理解酶的功能和机制至关重要，即使是很高分辨率的X射线衍射图谱，也很难反映到这样的细节。核磁共振波谱对化学环境的变化非常敏感，与X射线衍射图谱联合，可反映激酶三维结构的细节信息。Lai等在底物上标记13C和15N，并观察其化学位移，利用此项技术鉴别出色氨酸合成酶在活性催化形式下的吲哚啉醌中间产物。
NMR的优点在于可以检测非常细微的结构，可以检测酶促反应“稳态”之前的结构变化，缺点是敏感度较低。
2.5 毛细管电泳法(capillary electrophoresis, CE)
CE是一个利用微米或者纳米的毛细管管道进行分离的技术，在电场中，电泳液中的待分析物或因迁移速度不同被分离，或因电导率和pH的不同而被浓缩。Gratz等利用CE/UV方法检测了蛋白激酶CK2的活性。用2 mol/L的醋酸作为电解液，利用磷酸化和非磷酸化的多肽在电场中迁移率不同进行分离，在紫外光214 nm处检测。
CE的优点是分离环境是均相的体系，分析迁移的速度相对较容易，所需样品体积小，分析时间短，效率高；缺点是灵敏度低，提高样品浓度易产生样品堆积的现象。
武汉合研生物医药科技有限公司
- 地址：
- 武汉东湖高新区高新大道666号光谷生物城C1栋
